本发明属于兔养殖，尤其涉及一种培育生长速度提高兔品种的方法。
背景技术：
1、养殖业在我国经济所占比重正逐步上升，其中兔业的发展受到广泛的关注。随着现代生物技术的迅速发展、动物遗传繁育技术研究的不断深入以及产业化需求的增长，动物良种培育正经历从以数量性状为主的传统育种方法向基于快速基因型改变的分子育种技术的转变。新型crispr/cas9基因编辑技术spry-cbe的应用，实现了无限制pam突变，从而加速家兔重要生产性状的遗传育种计划，有利于提高动物经济价值。众多研究已采用候选基因方法来鉴定肉系动物中与经济相关性状(如肉质和胴体性状、繁殖和生长性状)相关的dna标记。值得注意的是，在人类非综合征家族性高大身材的临床案例中，其家族遗传候选变异基因鉴定时发现身材高大的成员在睫状基因家族cep104中p.g18s存在共同的杂合变异，这为遗传候选变异基因的鉴定提供了线索。
2、我国拥有丰富的兔地方品种资源，但这些品种普遍面临生长缓慢和产肉能力低等问题。为此本发明提出了一种培育生长速度提高兔品种的方法。
技术实现思路
1、本发明的目的在于提供一种培育生长速度提高兔品种的方法，旨在解决上述背景技术中提出的问题。
2、本发明的目的通过以下技术方案得以实现：
3、一种培育生长速度提高兔品种的方法，包括以下步骤：
4、步骤1：sgrna表达载体的构建；
5、针对新西兰兔cep104 p.gly25ser设计一条sgrna靶序列，合成一对寡聚核苷酸链，寡聚核苷酸链经95℃退火5min，冷却至室温，形成双链sgrna；使用bbsi限制性核酸内切酶对puc57载体进行线性化处理，并将线性化载体通过琼脂糖电泳后进行胶回收；最后将双链sgrna与线性化的puc57载体连接，完成puc57-sgrna载体的构建，然后经37℃酶切过夜，电泳跑胶后，使用普通dna琼脂糖胶回收试剂盒进行回收；
6、寡聚核苷酸链序列如下：
7、sgrna-f：gaagccgtcttcatgtccag；
8、sgrna-r：ctggacatgaagacggcttc；
9、步骤2：spry-cbe mrna的转录合成；
10、spry-cbe质粒在37℃下经酶切过夜形成线性dna，并通过琼脂糖凝胶电泳进行回收，回收产物通过氯仿抽提方式进行纯化，然后按照体外转录试剂盒使用说明进行spry-cbe的转录合成；
11、步骤3：胚胎显微注射技术制备cep104基因编辑兔；
12、将合成的sgrna和spry-cbe混匀后，吸至注射针内，进行胚胎细胞核注射，注射后的受精卵移植到同期发情的受体母兔输卵管内，母兔妊娠到25天后，转移到产房至预产期，最终获得cep104基因编辑兔；
13、步骤4：兔基因组鉴定；
14、从获得的cep104基因编辑兔耳组织提取dna，利用设计的pcr引物进行pcr，完成pcr后，进行电泳鉴定，若pcr扩增成功，对pcr产物进行dna测序，得到基因型鉴定结果；
15、设计pcr引物如下：
16、上游引物：ggatccacaacgctggtta；
17、下游引物：accctctgggacacaatttc。
18、进一步的，所述步骤1中，酶切体系为：puc57质粒20μl、10×buffer 20μl、bbsⅰ1μl和ddh2o 159μl；胶回收过程为：在37℃条件下酶切过夜，琼脂糖电泳跑胶后，使用普通dna琼脂糖胶回收试剂盒进行回收。
19、进一步的，所述步骤2中，酶切体系为：agei 1μl、xbai 1μl、spry-cbe质粒20μl、rcut smart buffer 10μl和ddh2o 18μl；
20、转录合成体系为：线性spry-cbe 1μg、ntpbuffer 10μl、t7 rnapolymerase 2μl和ddh2o 5μl；
21、转录合成过程为：混匀后，37℃孵育1h；转录完成加入1μldnasei消化转录模板，37℃反应15min，之后添加polya尾。
22、进一步的，所述步骤3的具体过程为：利用显微注射仪，将合成的12ng/μl的sgrna和70ng/μl的spry-cbe混匀后，吸出2.5μl至注射针内，进行胚胎细胞核注射，注射后的受精卵移植到同期发情的受体母兔输卵管内，母兔妊娠到25天后，转移到产房至预产期，最终获得cep104基因编辑兔。
23、进一步的，所述步骤4中，pcr反应体系为：模板dna 1.5μl、上游引物2μl、下游引物2μl、2×taqplus 12.5μl和ddh2o 7μl；pcr反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸40s；38个循环；72℃延伸5min。
24、进一步的，所述步骤4中，若在sgrna序列的第6位的c突变成t，则证明获得单碱基突变。
25、与现有技术相比，本发明的有益效果是：
26、本发明公开了一种利用spry-cbe基因编辑技术来培育生长速度提高兔品种的方法，该技术的优势在于没有对pam区域的序列识别限制。设计灵感来源于人类非综合征家族的高身材位点设计突变，本发明针对新西兰兔的cep104基因序列设计了特异性sgrna序列，实现对序列第6位的c位点进行碱基突变，经胚胎注射后进行胚胎移植，成功获得了生长速度提高的新兔品种。本发明不仅开拓了动物遗传选育的新思路，还创建了新的家兔模型或品系，有效提高了家兔的生长速度，实现了遗传性状的显著改良。这一成果对于促进我国畜牧养殖业的发展以及提升动物产业经济效益具有重要意义，同时也为提高动物经济价值提供了新的途径。
技术特征：1.一种培育生长速度提高兔品种的方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的培育生长速度提高兔品种的方法，其特征在于，所述步骤1中，酶切体系为：puc57质粒20μl、10×buffer 20μl、bbsⅰ1μl和ddh2o 159μl；胶回收过程为：在37℃条件下酶切过夜，琼脂糖电泳跑胶后，使用普通dna琼脂糖胶回收试剂盒进行回收。
3.根据权利要求1所述的培育生长速度提高兔品种的方法，其特征在于，所述步骤2中，酶切体系为：agei 1μl、xbai 1μl、spry-cbe质粒20μl、rcut smart buffer 10μl和ddh2o18μl；
4.根据权利要求1所述的培育生长速度提高兔品种的方法，其特征在于，所述步骤3的具体过程为：利用显微注射仪，将合成的12ng/μl的sgrna和70ng/μl的spry-cbe混匀后，吸出2.5μl至注射针内，进行胚胎细胞核注射，注射后的受精卵移植到同期发情的受体母兔输卵管内，母兔妊娠到25天后，转移到产房至预产期，最终获得cep104基因编辑兔。
5.根据权利要求1所述的培育生长速度提高兔品种的方法，其特征在于，所述步骤4中，pcr反应体系为：模板dna 1.5μl、上游引物2μl、下游引物2μl、2×taqplus 12.5μl和ddh2o7μl；pcr反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸40s；38个循环；72℃延伸5min。
6.根据权利要求1所述的培育生长速度提高兔品种的方法，其特征在于，所述步骤4中，若在sgrna序列的第6位的c突变成t，则证明获得单碱基突变。
技术总结本发明适用于兔养殖技术领域，提供了一种培育生长速度提高兔品种的方法。本发明利用SpRY‑CBE基因编辑技术来培育生长速度提高兔品种，针对新西兰兔的CEP104基因序列设计了特异性sgRNA序列，实现对序列第6位的C位点进行碱基突变，经胚胎注射后进行胚胎移植，成功获得了生长速度提高的新兔品种。本发明不仅开拓了动物遗传选育的新思路，还创建了新的家兔模型或品系，有效提高了家兔的生长速度，实现了遗传性状的显著改良。这一成果对于促进我国畜牧养殖业的发展以及提升动物产业经济效益具有重要意义，同时也为提高动物经济价值提供了新的途径。技术研发人员：李占军,姜立强,宋宇宁,武鑫宇受保护的技术使用者：吉林大学技术研发日：技术公布日：2025/7/24